遺伝子治療製品のウイルスクリアランス検証研究プロトコルに関する主要な設計上の考慮事項

ICH Q5A(R2)-国際調和財団

ICH Q5A(R2) は 2023 年 11 月 1 日に正式に採択され、ウイルスの安全性評価の中核となる国際ガイダンス文書となります。 1999 年に発行された Q5A(R1) と比較すると、R2 バージョンの重要な更新点は次のとおりです。連続製造におけるウイルスの安全性評価に関する章が新たに追加されました (第 7 章)。ウイルス排除戦略の基礎としてのリスク評価の役割の強化。ウイルス検出の考慮事項に次世代シーケンス（NGS）を組み込む-。新しい製品と製造プロセスを評価するための明確な要件。 Q5A(R2) は、FDA、EMA、PMDA などの規制当局によって採用されており、ウイルスクリアランス検証のための統一された技術フレームワークを世界中に提供しています。

NMPA-中国の規制制度

ウイルスの安全性に関する NMPA の規制枠組みは、複数のレベルをカバーしています。

ドキュメントレベル	文書名	発行年
基礎文書	血液製剤からのウイルスの除去・不活化に関する技術ガイドライン	2002
基礎文書	生体組織-派生製品および真核細胞-発現製品のウイルス安全性評価の技術レビューに関する一般原則	2005
製品固有のガイドライン-	In Vivo 遺伝子治療製品に基づく組換えアデノ-関連ウイルス (rAAV) ベクター-の医薬品研究および臨床試験申請の評価に関する技術ガイドライン	2023
製品固有のガイドライン-	販売承認申請のための組換えアデノ-関連ウイルス（rAAV）ベクター-ベースの生体内遺伝子治療製品の医薬品品質に関する共通の技術要件	2025
革新的なガイドライン	治療用組換えタンパク質製品（治験）の臨床試験申請におけるウイルスクリアランスプロセスのプラットフォーム検証に関する技術ガイドラインa	2024

a: このガイドラインは、中国の規制当局がウイルス除去プロセスのプラットフォーム検証に関する体系的な技術要件を初めて定めたものであり、ICH Q5A(R2)の精神に沿ったものです。

FDA および EMA-米国および欧州の規制要件

FDA は、2024 年 1 月に ICH Q5A(R2) に基づく業界ガイダンス文書を正式に発行しました。さらに、米国薬局方 (USP) の章<1050.1>ウイルス除去手順の設計、評価、および特性評価に関する補足的な技術ガイダンスを提供します。 FDA は 2 年ごとにウイルスクリアランスシンポジウムを開催します。 2023 年のシンポジウムでは、新しいモダリティ、連続製造、新しいクロマトグラフィー媒体、吸着フィルターなどの最先端のトピックが取り上げられました。{2} EMA の中核となるガイダンス文書には、CPMP/BWP/268/95 (ウイルス検証研究に関するガイダンスに関する注記: ウイルスの不活化と除去を検証する研究の設計、貢献および解釈) および EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (バイオテクノロジー治験薬のウイルス安全性評価に関するガイドライン) が含まれており、どちらも次の文書と調和されています。 ICH Q5A(R2)。

ウイルス汚染源の特定

ICH Q5A(R2) は、ウイルスクリアランス検証の設計は包括的なリスク評価に基づくべきであることを強調しています。遺伝子治療製品の場合、ウイルス汚染源の特定により、以下のレベルに対応する必要があります。

細胞バンクレベル: 内在性ウイルス (例: レトロウイルス粒子) および生産細胞基質に潜在的に存在する潜在的感染性ウイルス (例: HEK293、CHO、HeLa)。 HEK293 細胞は、内在性 Ad5 E1 配列と約 900 bp の EBV フラグメントを含むことが知られており、複製能力のあるアデノウイルスを発現することができます。{10}したがって、リスク評価ではこのリスクに特に注意を払う必要があります。

ヘルパー ウイルス レベル: AAV ベクターの作製には通常、ヘルパー プラスミドを使用したトリプル トランスフェクションなどの方法が採用されており、複製能力のあるアデノウイルス（RCA）が生成されるリスクが伴います。{0}同様に、レンチウイルス ベクターの生産に使用されるパッケージング細胞は、複製能力のあるレンチウイルス (RCL) を生成する可能性があります。{2}

原材料レベル: 外来ウイルスは、細胞培養培地、飼料、酵素などの製造に使用される原材料を介して侵入する可能性があります。このリスクは、動物由来の成分（ウシ胎児血清、トリプシン消化溶液など）が使用される場合に特に重大です-。

リスクの違い: 遺伝子治療と従来の組換えタンパク質

リスクの次元	従来の組換えタンパク質製品	遺伝子治療製品
ウイルス源	細胞バンクからの内因性ウイルス。外来ウイルス	細胞バンクウイルス。ヘルパーウイルス。レプリケーション-コンピテントベクター（RCV/RCL）;宿主ゲノムの統合
細胞基板	CHO、NS0、Sp2/0 およびその他のよく特徴付けられた細胞株-	HEK293、HeLa、CHOなど。一部の細胞株は腫瘍形成起源のものです
製品の特徴	タンパク質-ベースの薬。明確に定義された構造-	ウイルスベクター。バイオセーフティのリスクを引き起こす
検証戦略	多段階のウイルス除去。-プロセスステップの検証を重視する	RCV/RCL 検出が必要です。検証とテストは両方とも不可欠です
プラットフォームの検証	S/D、低pH、ナノろ過などの確立されたプロセスに適用可能	ベクターの種類が多様であるため、適用可能性が限定される

表 1. ウイルスの安全性リスクの比較: 遺伝子治療製品と従来の組換えタンパク質製品

一般原則

指標ウイルスの選択は、ウイルスクリアランス検証プロトコルの設計における中心的な要素です。 ICH Q5A(R2) では、指標ウイルスの選択はリスク評価に基づき、以下の要素を考慮することが求められています。

生産細胞基質に対するウイルスの関連性 (関連ウイルス)

ウイルスの物理化学的特性（エンベロープ付き/非エンベロープ、DNA/RNA、サイズ範囲）{0}

物理的/化学的処理に対するウイルスの耐性

ウイルスの検出可能性と生物学的安全性

遺伝子治療製品の場合、インジケーターウイルスの選択では、以下をさらに考慮する必要があります。「関連ウイルス」としてのベクターウイルス自体の役割。ヘルパーウイルス汚染の潜在的なリスク。そして複製能力のあるウイルス（RCV/RCL）の検出と検証の要件{0}。

推奨インジケータウイルスパネル

ウイルス	タイプ	封筒	ゲノム	サイズ (nm)	選定理由・用途
MVM	パルボウイルス	なし	ssDNA	18–26	非エンベロープ モデル。-最小のサイズと最高の抵抗。ナノろ過検証に適しています (通常、rAAV ベクター製品には適用されません)
PPV	パルボウイルス	なし	ssDNA	18–26	非エンベロープ モデル。-血液製剤に一般的に使用される指標ウイルス
レオ-3	レオウイルス	なし	dsRNA	60–80	非エンベロープ モデル。-中くらいの大きさ。高い物理的安定性
PRV	ヘルペスウイルス科	はい	二本鎖DNA	150–200	エンベロープモデル。大きいサイズ。広いホスト範囲
X-MuLV	レトロウイルス	はい	ssRNA	80–110	エンベロープ付きレトロウイルスモデル。 CHO-由来の細胞基質に適しています
BVDV	フラビウイルス科	はい	ssRNA	40–60	エンベロープモデル。化学的不活化方法を評価するために使用されます (HCV サロゲート)
VSV	ラブドウイルス科	はい	ssRNA	70	エンベロープモデル。広いpH耐性。低 pH 不活化検証に適しています-

表 2. 遺伝子治療製品のウイルスクリアランス検証に推奨される指標ウイルスパネル

AAV ベクター製品に関する特別な考慮事項

組換え AAV ベクター製品については、NMPA の rAAV ベクターベースの In Vivo 遺伝子治療製品の医薬品研究および臨床試験申請の評価に関する技術ガイドライン-により、複製能力のある AAV (rcAAV) の検出に注意することが求められています。- rcAAV は、自律複製可能な AAV を指し、通常、ヘルパー プラスミドと生成物 AAV ゲノムの間の相同組換えから生じます。 rcAAV の検出は一般に、感染性アッセイまたは qPCR 法を使用して行われ、原薬と精製産物に対して別々に行われます。

AAV ベクター産物の下流精製プロセスには、通常、ヌクレアーゼ消化、クロマトグラフィー (AEX)、ナノ濾過、およびイオン交換クロマトグラフィー (CEX/IEX) が含まれることに注意してください。従来のウイルスクリアランス検証では、これらのプロセスステップにより、AAV ベクター自体が大幅に失われる可能性があります。したがって、スケールダウン モデルの設計時には、ベクター ウイルスとインジケーター ウイルスの間の相互作用を慎重に考慮する必要があります。- AAV ベクターの損失が大きい特定のプロセスステップ (ナノろ過など) では、検証データ (ナノろ過膜の孔径の調整など) に基づいてプロセス調整が保証されるかどうかを評価する必要があります。

一般原則

スケールダウン モデル（SDM）はウイルス クリアランス検証の中核ツールです。-その設計は、製造プロセスのウイルス除去性能を正確に表現する必要があります。 ICH Q5A(R2)、セクション 6.2.2 では、スケールダウン モデルが主要なパラメータにおいて製造プロセスとの一貫性を維持することを明示的に要求しています。-遺伝子治療製品の場合、SDM 設計では次の考慮事項が特に重要です。

重要なプロセスパラメータの代表性

スケールダウン モデルは、次のパラメータにおいて製造プロセスと一致している必要があります。クロマトグラフィー条件（緩衝液組成、pH、導電率）。-ローディング比 (ベクター/上清タンパク質の質量比);接触時間と温度。流量/滞留時間。製品の純度と組成。 AAV 製品の場合、ナノろ過性能に対するベクターの粒度分布と空のキャプシド含有量の影響にも特に取り組む必要があります。

モデルの資格要件

ICH Q5A(R2) では、以下を含むスケールダウン モデルの適切な認定が必要です。製品の品質属性 (純度、回収率、密度など) の比較。重要なプロセスパラメータの一貫性の評価。そして、スケールダウン モデルが製造プロセスのプロセス変動を確実に把握できるようにします。-クロマトグラフィーのステップでは、ピークプロファイル、溶出、および洗浄の一貫性を評価する必要があります。ナノ濾過ステップでは、体積容量と製品組成の影響を検証する必要があります。

LRVの計算式

対数減少値 (LRV) は、ウイルス除去効果を測定するための中心的な指標です。 ICH Q5A(R2) のセクション 6.5 では、LRV の計算方法と統計的処理について詳細に説明しています。基本的な LRV 計算式は、LRV=log₁₀(N₀/N) です。ここで、N₀ はウイルススパイク後の初期ウイルス力価、N はプロセス処理後の残留ウイルス力価です。残留ウイルス力価がアッセイの検出限界を下回る場合は、ポアソン分布などの推定方法を使用する必要があります（大容量検査など）。-。

信頼区間の適用

ICH Q5A(R2) と EMA CPMP/BWP/268/95 は両方とも、LRV 計算結果の信頼区間評価を必要とします。通常は 95% の信頼区間が適用されます。

有効性の基準

NMPA の血液製剤からのウイルスの除去/不活化に関する技術ガイドラインによれば、4 log 以上のウイルス減少は、そのプロセスステップがウイルスの除去/不活化に効果的であることを示します。ただし、この基準は絶対的な閾値ではなく、不活化反応速度曲線、指標ウイルス選択の科学的根拠、および検証プロトコル設計の全体的な健全性とともに、総合的な方法で評価される必要があります。遺伝子治療製品の場合、全体的なウイルスの安全性プロファイルが許容可能なレベルであることを確認するために、すべてのプロセス段階にわたる累積クリアランス能力に特別な注意を払う必要があります。

ナノ濾過の応用と課題

ウイルス-保持濾過（ナノ濾過）は、遺伝子治療製品の下流精製における重要なウイルス除去ステップです。一般的なウイルス保持フィルターの孔径は約 20 nm です。-ナノ濾過のウイルス除去メカニズムは主にサイズに基づいた排除であり、MVM や PPV などの非エンベロープ小型パルボウイルスを含む、膜孔径より大きいほとんどのウイルスを効果的に除去できます。-

しかし、遺伝子治療製品のナノろ過は特有の課題に直面しています。AAV ベクターのサイズ (約 20 ～ 26 nm) は、特定の指標ウイルス (MVM、18 ～ 26 nm など) のサイズと類似しているため、ベクターの回収率が低下する可能性があります。空のキャプシドは濾過流束とウイルス保持効率に影響を与える可能性があります。サンプルの粘度は、ベクターの濃度とともに大幅に増加する可能性があります。したがって、ナノろ過検証のための SDM 設計では、ろ過性能に対するベクター粒子サイズ分布と空キャプシド含有量の影響を十分に考慮する必要があり、必要に応じてより大きな細孔サイズを備えたナノろ過膜の使用を考慮する必要があります。

クロマトグラフィーステップのウイルスクリアランス評価

イオン交換クロマトグラフィー (IEX) は AAV 生成物精製プロセスの中核ステップであり、通常はヌクレアーゼ消化に続いて陰イオン交換クロマトグラフィー (AEX) を使用して空のキャプシドや欠陥のあるキャプシドを捕捉するか、陽イオン交換クロマトグラフィー (CEX) を使用して完全なキャプシドを精密に精製します。クロマトグラフィーステップにおけるウイルス除去メカニズムには、サイズ排除、静電相互作用、親和性相互作用、およびその他の要因が含まれます。 FDA 2023 ウイルスクリアランスシンポジウムでの議論では、クロマトグラフィーステップのウイルスクリアランス効果がローディングキャパシティ、pH、導電率、樹脂サイクルなどの複数の要因によって影響されることが強調されました。総合的な評価には、多要素直交設計アプローチを採用する必要があります。-

連続製造におけるウイルスの安全管理

ICH Q5A(R2) の新たに追加された第 7 章では、連続製造におけるウイルスの安全性評価に関する特定の要件が定められています。遺伝子治療製品では、連続製造が重要な開発方向となっていますが、これはウイルスの安全性に関する新たな課題ももたらします。連続製造におけるウイルス安全管理戦略には、次のものが含まれます。-重要な封じ込め対策としてのインライン ウイルス バリア フィルター。滞留時間とプロセスフローの適切な設計。定義された保持時間による不活化ステップの組み込み。重要なプロセス パラメータをリアルタイムで監視するためのプロセス分析技術 (PAT) の応用を強化しました。-